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WB-封闭和抗体孵育

1.封闭

利用惰性蛋白。非离子去污剂,或无蛋白的封闭剂来封闭膜上未被占据的位点,从而减少抗体的非特异性结合。封闭剂与膜的亲和力应高于抗体,并且不会替换膜上的目的蛋白。


通常有两种常用的封闭剂,牛血清白蛋白(BSA)和脱脂牛奶。以下我们简述了这两种封闭剂使用的各自特点和i 注意事项,帮助选择更适用于您实验本身的封闭剂。

 

脱脂牛奶 :性价比高; 通常使用浓度为2.5%~5%; 不能用于磷酸化蛋白,因为脱脂奶粉中的酪蛋白本身是一种磷酸化蛋白,会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。

 

牛血清蛋白(BSA):通常使用浓度为2%~5%; 某些抗体用BSA封闭会产生比脱脂牛奶更强的信号,确定抗体使用的特殊需求,进行选择适当的封闭剂。封闭时间一般在1h,避免封闭时间过长导致掩盖抗原表位,阻止抗体结合。封闭后于TBST中洗涤5 min,TBST中的吐温-20去污剂,对抗原具有复性作用,从而提高特异性识别。

 

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abs49001012/14

BSA

50/100 g

封闭

abs47014957

Skim Milk

100/500 g

封闭

5217

Bovine Serum Albumin

100g

封闭

 

2.抗体孵育原理

目的蛋白印迹在膜上,经过封闭之后,印迹目的蛋白与一个或多个抗体孵育。第一个抗体(一抗)与目的蛋白结合,而第二个抗体(二抗)与第一个抗体结合,二抗本身结合有酶或染料,可用来指示蛋白的位置。不过有些一抗也具有直接标记的功能,但使用标记二抗有明显优势。首先不止一个二抗分子能与单个一抗分子结合,形成信号;其次,标记的二抗可用于大量不同特异性的一抗,因而无需标记多个一抗。

 

3.抗体的选择

在对于任何一种目的蛋白,都有不止一种有效抗体。为缩小选择的范围,我们通常要考虑以下几个方面:

①分析或应用类型
主要参考厂家提供的抗体数据表。有时,未说明的用途没有列出,仅表示抗体未检测是否具有该用途或不知道抗体如何发挥作用。

②样品的性质
对于样品的性质,我们至少要考虑以下两方面:
a.要检测的蛋白区域。如果要检测的是一个蛋白片段或全长蛋白的异构体或特定区域,那就要求选择的抗体是由该特异片段等的免疫原刺激产生的。
b.样品的处理工艺。有些抗体仅识别降解或变性蛋白,有些抗体仅识别天然蛋白抗原表位,因此要根据实验样品处理的具体情况选择抗体的使用。

③抗体的种类
多克隆一抗和单克隆一抗都可以使用,但要注意,变性蛋白可能无法被天然抗原制备的抗体所识别。一般来说,用标记二抗来检测非标记一抗时,产生一抗的宿主动物的类别也是不同的。在进行WB的细胞裂解液被认为不含有IgG;而组织溶解液和组织培养上清(含血清)被认为含IgG。在进行WB实验时,IgG会以50和25kDa的条带出现在降解和变性样品中,分别相当于IgG的重链和轻链。 在二抗种类的选择上,二抗应来源于产生一抗的物种。

④抗体的标记和检测
标签结合在抗体上使抗体的结合可见,选择标签抗体以检测方法的为依据进行选择。一般推荐使用HRP标记二抗,不建议使用碱性磷酸酶(AP)标记二抗,因其不够灵敏。

 

4.抗体的稀释使用

所使用的稀释溶剂可选择含有低浓度封闭剂的TBST或不含有封闭剂的TBST,含有封闭剂的TBST稀释抗体,在孵育过程中可以相应减少非特异性吸附,避免背景过高的现象。抗体稀释溶剂TBST中一般都含有0.1%的吐温-20去污,可防止抗体的非特异性聚集,但要知道,吐温-20浓度高于0.05%(v/v)时,就有可能从膜上洗掉一些印迹蛋白。


按照抗体说明书建议的稀释倍数进行稀释使用,有时一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。一般来说,高倍稀释一抗可减少非特异性信号,高倍稀释酶标二抗可最大限度降低整体的高背景。

 

5.抗体孵育时间和温度

一抗的孵育时间可从几小时至过夜(一般不超过18h)不等具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度。一般建议使用较高的抗体稀释倍数结合较长的时间孵育,以保证特异性结合。若孵育时间较长应在4℃进行。


二抗孵育在一抗结束后,TBST洗膜5min以去除残留一抗。孵育一般在室温下1-2h。

 

抗体及相关产品推荐

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abs954

WB专用一抗二抗稀释液

100 ml

稀释抗体

901-0005

HRP Conjugate Stabilizer/Diluent

50 ml

稳定HRP结合

5127S

Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate)

100 μl

二抗

46387S

Anti-Blue (2D2F11) Mouse mAb (HRP Conjugate)

100 μl

二抗

SNAPi.d.2.0

Millipore Western Blotting加速器

1台

加速WB封闭至二抗孵育步骤,缩短至30min

 

6.清洗

清洗转印膜可从膜上去除未结合的抗体或多余封闭剂,它们会导致高背景和检测不佳。常用清洗缓冲液是含有吐温-20的PBS或TBS稀释液。如前所述,高浓度的去污剂可能会使目的蛋白从膜上洗脱。而对于高度纯化抗体,往往使用不含去污剂的缓冲液进行清洗。


清洗次数和时间根据具体实验来确定,清洗过少会产生过高背景;过度清洗会洗脱目的蛋白或降低信号。建议清洗3-5次,每次5min。


在TBS清洗液中添加最多0.5M的NaCl和0.2%的SDS,并将清洗延长至2h,可降低顽固背景。

 

清洗相关产品推荐

产品货号

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用途

abs961/2

PBS缓冲液

100 ml/1 L

清洗

abs952

10*TBST

500 ml

清洗

abs42028945

Tween-20

500 ml

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